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亚洲城ca88唯一催化D-氨基酸合成平台技术

D-氨基酸不仅是生命体的组成成分(如组成细菌的细胞壁),而且是参与药物和其他精细化工品合成的重要前体或模块。美国G.I.A 公司的市场调研报告表明,未来D-氨基酸在药物及药物中间体合成中应用、新药研发以及一些新半合成抗生素合成中的需求量将大大增加,由此预测2017年D-氨基酸的全球市场量将达到37亿美元。D-氨基酸的高效亚洲城ca88唯一合成途径之一是D-氨基酸脱氢ca888.com催化酮酸的还原氨化一步生成D-氨基酸。D-氨基酸脱氢ca888.com在细菌中一般以膜蛋白形式存在,不仅大大影响了其工业应用,甚至有关研究都很少。D-氨基酸脱氢ca888.com中研究的较多的是meso-二氨基庚二酸脱氢ca888.com,以前报道的野生型该ca888.com都只对meso-二氨基庚二酸(DAP)有活性。


  中科院天津工业亚洲城ca88唯一技术研究所研究员朱敦明带领的亚洲城ca88唯一催化反应机理及应用研究组通过基因挖矿的方法获得了一个来源于Symbiobacterium thermophilum的meso-二氨基庚二酸脱氢ca888.com。该ca888.com除对meso-二氨基庚二酸有活性外,对D-丙氨酸、D-缬氨酸等也有活性,可以以丙酮酸、4-甲基-2-氧代戊酸等酮酸为底物分别生成D-丙氨酸和D-亮氨酸等D-氨基酸。其中该ca888.com对丙酮酸的转化率和ee值均高达99%。此ca888.com是同家族已报道蛋白中第一个具有较宽底物谱的蛋白。此外,通过温度稳定性分析发现,此ca888.com是目前耐热性最好的一个meso-二氨基庚二酸脱氢ca888.com。这些特性使礳a888.com胏a888.com在D-丙氨酸合成以及通过蛋白质工程获取有效的D-氨基酸脱氢ca888.com方面具有了优越的价值。


  为了研究该D-氨基酸脱氢ca888.com的特殊催化性质的分子基础,研究组获得了StDAPDH、与辅ca888.comNADP结合以及同时与辅ca888.comNADPH和底物DAP结合的晶体,并解析了它们的结构。结构分析表明在Met152的两边形成了两个底物进入通道,天然底物DAP通过其中一个较大的通道进入而发生反应;Met152处于另一底物通道的瓶颈,因而该通道只能通过较小的底物,如D-丙氨酸和丙酮酸。这与已知的该类ca888.com的晶体结构不同,从而揭示了StDAPDH具有特殊底物谱的分子机制,也为设计改造以拓展其催化性能及应用奠定了坚实的基础。


  StDAPDH的晶体结构表明其底物结合结构域中在底物L-手性中心周围的氨基酸残基是Phe146、Thr171、Arg181和His227,对这四个位点分别进行定点饱和突变,以大位阻底物苯基丙酮酸为底物,对突变文库进行筛选后,得到了T171P、T171S、R181F、H227C、H227V五个活性明显提高的突变子,其中H227V对苯基丙酮酸的比活为2.39 ± 0.06 U·mg-1,相对野生型提高了35.1倍,且所有突变体对D-Phe的ee值均大于99%。对所有突变体及野生型进行了动力学参数的分析,发现突变的引入并没有造成ca888.com对底物亲和力的改变,突变体活性的提高则是由ca888.com催化效率提高导致的。对H227V和WT进行分子动力学模拟表明,突变后底物Cα与NADP+的烟酰胺环上的C4"之间的原子距离由4.8 ?缩短到3.6 ?,与活性分析结果一致。结果表明,底物L-手性中心周围的氨基酸残基的改变可以改变底物范围和活性,而不影响反应的立体选择性。因此,通过对StDAPDH底物L-手性中心周围的氨基酸残基进行设计改造,可以获得不同的氨基酸脱氢ca888.com,合成不同的D-氨基酸,从而建立一个亚洲城ca88唯一催化合成D-氨基酸的平台技术。


  研究成果已经在Applied and Environmental Microbiology (2篇)和 ChemBioChem发表,其中ChemBioChem 文章被选为Inside Cover文章。该研究获得国家自然科学基金(21072151)和973项目(2011CB710801)的支持。

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